La prégabaline n'est pas un agoniste des récepteurs GABAA ou GABAB.
La prégabaline est un gabapentinoïde et agit en inhibant certains canaux calciques. Plus précisément, il s'agit d'un ligand du site auxiliaire de la sous-unité α2δ de certains canaux calciques dépendants du potentiel (VDCC), et agit ainsi comme un inhibiteur des VDCC contenant la sous-unité α2δ. Il existe deux sous-unités α2δ de liaison au médicament, α2δ-1 et α2δ-2, et la prégabaline présente une affinité similaire pour (et donc un manque de sélectivité entre) ces deux sites. La prégabaline est sélective dans sa liaison à la sous-unité α2δ VDCC. Bien que la prégabaline soit un analogue du GABA, elle ne se lie pas aux récepteurs GABA, ne se transforme pas en GABA ou en un autre agoniste des récepteurs GABA in vivo et ne module pas directement le transport ou le métabolisme du GABA. Cependant, il a été constaté que la prégabaline produit une augmentation dose-dépendante de l'expression cérébrale de l'acide L-glutamique décarboxylase (GAD), l'enzyme responsable de la synthèse du GABA, et peut donc avoir des effets GABAergiques indirects en augmentant les niveaux de GABA dans le cerveau. Il n'existe actuellement aucune preuve que les effets de la prégabaline soient médiés par un mécanisme autre que l'inhibition des VDCC contenant α2δ. Conformément, l'inhibition des VDCC contenant α2δ-1 par la prégabaline semble être responsable de ses effets anticonvulsivants, analgésiques et anxiolytiques.
Les acides aminés α endogènes L-leucine et L-isoleucine, qui ressemblent beaucoup à la prégabaline et aux autres gabapentinoïdes dans leur structure chimique, sont des ligands apparents de la sous-unité α2δ VDCC avec une affinité similaire à celle des gabapentinoïdes (par exemple, IC50 = 71 nM pour L- isoleucine), et sont présents dans le liquide céphalo-rachidien humain à des concentrations micromolaires (par exemple, 12,9 µM pour la L-leucine, 4,8 µM pour la L-isoleucine). Il a été théorisé qu'ils pourraient être les ligands endogènes de la sous-unité et qu'ils pourraient antagoniser de manière compétitive les effets des gabapentinoïdes. En conséquence, bien que les gabapentinoïdes comme la prégabaline et la gabapentine aient des affinités nanomolaires pour la sous-unité α2δ, leurs puissances in vivo se situent dans la plage micromolaire faible, et la compétition pour la liaison par les acides aminés L endogènes serait probablement responsable de cet écart.

Dans une étude, il a été constaté que la prégabaline possédait une affinité 6 fois supérieure à celle de la gabapentine pour les VDCC contenant la sous-unité α2δ. Cependant, une autre étude a révélé que la prégabaline et la gabapentine avaient des affinités similaires pour la sous-unité α2δ-1 recombinante humaine (Ki = 32 nM et 40 nM, respectivement). Dans tous les cas, la prégabaline est 2 à 4 fois plus puissante que la gabapentine comme analgésique et, chez les animaux, elle semble être 3 à 10 fois plus puissante que la gabapentine comme anticonvulsivant.